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蝦青素對小鼠急性乙醇肝損傷的保護作用

 

蝦青素對小鼠急性乙醇肝損傷的保護作用

 

作者:裴凌鵬, 惠伯棣

作者單位:(中央民族大學少數民族傳統醫學研究中心,北京100081

北京聯合大學應用文理學院,北京 100083)

 

【摘要】  目的: 研究ASTA蝦青素對乙醇所致小鼠急性化學性肝損傷的保護作用。方法: 雄性小鼠60只,隨機分為正常對照組、急性乙醇肝損傷模型組、聯苯雙酯陽性對照組(15 mg/kg)以及蝦青素低、中、高劑量組(1015,20 mg/kg)6組。測定并比較各組小鼠肝臟系數,血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSHpx)活性與丙二醛(MDA)含量;測定肝組織中SOD,GSHpx活性,MDA含量以及組織病理系數。結果: 各劑量蝦青素均能升高急性乙醇肝損傷小鼠血清與肝組織中SOD,GSHpx活性(P<0.01),降低血清ALT,AST活性(P<0.01),降低血清與肝組織MDA含量(P<0.01),并能不同程度地改善肝臟病理組織損傷。結論:ASTA蝦青素對乙醇所致急性肝損傷具有預防性保護作用。

【關鍵詞】  蝦青素; 乙醇肝損傷; 抗氧化

 

乙醇性脂肪肝(alcoholic fatty liver diseaseAFLD)是指由于乙醇攝入過量而導致的肝臟一系列損害病變。肝臟中過量的乙醇及其氧化代謝產物可誘導肝細胞微粒體酶細胞色素P450系統活性,特別是與乙醇代謝有關的高活性氧化代謝酶CYP2E1活性升高,進而通過CYP2E1的氧化代謝產生大量活性氧自由基(reactive oxygen speciesROS)ROS具有極強的氧化攻擊特性,可直接攻擊細胞器、DNA及具有重要功能的蛋白信號因子,導致肝細胞損傷及肝功能異常等。

蝦青素是一種類胡蘿卜素,主要以全反式異構體形式存在于海洋動物體、藻體及多數陸生植物體內并具有多種生物學功能,如抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌等作用,其中總抗氧化能力為維生素E的近20倍。

隨著蝦青素消費市場的不斷擴展,國內外研究機構開始集中圍繞其預防與治療疾病潛在機理進行探索性研究,目前尚未見有關蝦青素對急性乙醇肝損傷影響的報道。為此本實驗就這一問題進行了初步的研究工作。

 

1          材料與方法

1.1    主要儀器和試劑

Labconco冰凍真空干燥儀(法國樂高公司),752分光光度計,AE100電子天平(中國伯樂公司),電熱三用水箱,KA1000型臺式離心機(中國杭州華亭公司),960型熒光分光光度計,J2SH高速冰凍離心機(日本島津公司),C30柱(YMC Carotenoid S5Waters),HPLCWaters 600E溶劑輸送系統,PDA2996二極管陣列檢測器Waters),聯苯雙酯(北京協和制藥廠),丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GSHpx)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所),全反式蝦青素乳化顆粒(瑞士羅氏DMS公司),乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)(美國迪馬公司),無水乙醇(北京化學試劑公司),大孔吸附樹脂(天津農業股份公司)。

1.2    乳化劑破乳制備蝦青素

1.2.1           有機萃取  稱取10 g乳化顆粒加入少許水,超聲波促溶后,加入300 ml丙酮-正己烷萃取。靜置2 h后,將脂溶性相收集(反復萃取直至水相成無色)。再利用減壓旋轉蒸發儀進行提取液濃縮處理。

1.2.2  蝦青素提取液柱色譜純化  1)裝柱 將活化好的氧化鋁裝填于玻璃層析柱中,裝填高度為12 cm,用正己烷潤濕。(2)洗脫 分別取2 ml蝦青素提取液上柱,用50 ml正己烷-丙酮淋洗,收集洗脫液。將洗脫液用氮氣吹干制粉,裝入充滿氮氣的玻璃瓶內,-70儲存備用。

1.3  蝦青素鑒定

參照全反式蝦青素標準品,根據其HPLC中保留時間和紫外可見吸收光譜的特征峰進行鑒定。得到的蝦青素提取液經過過濾后用高效液相色譜分離。色譜柱:Waters YMC Carotenoid S5(4.6 mm×250 mm);流動相A:乙腈-甲醇(7525;流動相BMTBE;流動相AB中分別加入0.05%三乙胺作為改性劑防止蝦青素降解;線性梯度洗脫:B8 min內由0%增加至55%835 min B維持55%3540 min B55%減至0%;流速1.0 ml/min;檢測波長: λ/nm=475;波長范圍260700 nm;進樣量20 μl。收集后觀察其光譜特征峰行為。色譜和光譜分析結果表明實驗所用灌胃物為全反式蝦青素,純度為95%

1.4  動物實驗

1.4.1  乙醇誘導動物急性肝損傷模型的建立  60只小鼠(購自中國軍事醫學科學院實驗動物養殖中心,醫動字第07231號)隨機分組,設空白對照組、急性乙醇肝損傷模型組、聯苯雙酯組(15 mg/kg水溶混懸液)、蝦青素高劑量(20 mg/kg) 、蝦青素中劑量(15 mg/kg)、蝦青素低劑量組(10 mg/kg)6組,每組10只。按體質量20 ml/kg用聯苯雙酯和不同劑量的蝦青素分別給相應各組灌胃,每天1次。正常組與模型組每天灌服等體積的純凈水,連續14 d。最后一次用藥1 h后造模,除空白對照組外,其余5組小鼠均腹腔注射50%乙醇溶液,劑量為10 ml/kg;空白對照組同法腹腔注射等量的水,禁食(自由飲水)16 h后各組經眼球后靜脈叢取血,3 000 r/min離心10 min分離血清,測定各組血清中ALT,AST,SOD,GSHpx,MDA水平。開胸后,取肝臟,用4 生理鹽水沖洗,濾紙吸干,稱重,計算肝臟系數。臟器系數(%)=臟器質量(g)/體質量(g)×100%。取肝右葉相同部位的一小塊肝組織,以4生理鹽水制成10 %肝勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清,測定各組肝組織SOD,GSHpx,MDA;取肝左葉標本浸于4%的甲醛溶液中固定,切片,蘇丹染色5 min,甘油明膠封固,評估肝臟的脂肪變性情況。

1.4.2  生化指標測定  ALT,AST水平測定采用賴氏法;MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法;SOD活性測定采用亞硝酸鹽法;GSHpx活性測定采用55雙硫代對硝基苯甲酸(DTNB)顯色法。

1.4.3  肝臟組織病理學檢查  評估肝臟的脂肪變性情況,評分標準為,0分:肝細胞內脂滴散在,稀少;1分:含脂滴的肝細胞不超過1/4(散在分布)2分:含脂滴的肝細胞不超過1/2(散在分布)3分:含脂滴的肝細胞不超過3/4(彌散分布)4分:肝組織幾乎被脂滴代替(波及整個肝組織切片)

1.4.4  統計處理  所有數據用均數±標準差(±s)表示,用SPSS10.0統計軟件進行統計,組間差異比較用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

 

結果

2.1    各組小鼠血中相關生化指標及肝重系數

與正常對照組比較,急性乙醇肝損傷模型組小鼠血中SOD,GSHpx活性顯著降低(P<0.01),而ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數顯著增加(P<0.01)。與急性乙醇肝損傷模型組比較,蝦青素各劑量組和聯苯雙酯組血中SOD,GSHpx活性明顯升高,ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數明顯降低(P<0.01)。與蝦青素低劑量組比較,蝦青素中、高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P<0.01)ALT,AST活性,MDA含量和肝重系數降低(P<0.01)。與中劑量組比較,蝦青素高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P<0.01)ALT,AST活性和MDA含量降低(P<0.01),顯示出一定的劑量反應關系(表1)。

2.2    各組小鼠肝臟相關生化指標及組織脂肪變性評分

與正常對照組比較,急性乙醇肝損傷模型組小鼠肝臟SOD,GSHpx活性顯著降低(P<0.01),而MDA含量顯著增加(P<0.01)。與急性乙醇肝損傷模型組比較,蝦青素各劑量組和聯苯雙酯組小鼠肝臟組織中SOD,GSHpx活性明顯升高,MDA含量明顯降低(P<0.01)。與蝦青素低劑量組比較,蝦青素中、高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P<0.01)MDA含量降低(P<0.01);與中劑量組比較,蝦青素高劑量組SOD,GSHpx活性升高(P<0.01)MDA含量降低(P<0.01),顯示出一定的劑量反應關系。此外,蝦青素各劑量組小鼠肝臟病理組織檢查評分均明顯低于急性乙醇肝損傷模型組(P<0.01),見圖1

各組小鼠血清中SOD, GSHpx, ALT, AST活性和MDA含量(略)

Tab 1  SOD,GSHpx, ALT, AST activity and MDA content in mice serum

a: P<0.01,與對照組相比;b:P<0.01, 與模型組相比;c:P<0.01,與聯苯雙酯組相比;d:P<0.01,與低劑量組相比;e:P<0.01, 與中劑量組相比

各組小鼠肝臟組織中SOD,GSHpx活性,MDA含量和病理組織脂肪變性評分(略)

Tab 2  SOD,GSHpx activity, MDA content and pathology index in mice liver

a:P<0.01, 與對照組相比;bP<0.01,與模型組相比; cP<0.01,與聯苯雙酯組相比; dP<0.01,與低劑量組相比;eP<0.01,與中劑量組相比

 

3     討論

各種有害因素所致的肝損傷可表現為肝壞死、脂肪肝、膽汁淤積、肝纖維化、肝硬化及肝癌等,對肝損傷的防治目前仍是一個全球性的嚴峻課題。因此通過建立實驗性肝損傷動物模型,研究肝病的發生機制,篩選保肝藥物,探索保肝作用原理,具有重要的現實意義。乙醇對肝損傷的毒性作用是通過脂質過氧化作用進行的。乙醇在代謝中激活的氧自由基,可與肝細胞內大分子發生共價結合,也可使肝細胞膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化,從而損傷肝細胞膜的結構和功能,使膜通透性升高,導致細胞腫脹壞死。

乙醇氧化產生的乙醛具有毒性作用,可抑制烷基化核蛋白的修復,降低肝酶的活性;同時,乙醇的長期攝入顯著降低了線粒體的氧利用率。反過來,線粒體氧化容量的受損也會干擾乙醛的氧化,從而形成惡性循環,導致乙醛逐漸累積并加重線粒體的損傷。而且,乙醛可以減少還原型谷胱甘肽(GSH)的濃度,引起脂質過氧化反應,增加自由基的毒性作用,促進細胞凋亡。乙醛結合微管上的微管蛋白,阻礙蛋白質的分泌,形成的乙醛-蛋白促使膠原產生,可以作為腫瘤抗原,刺激免疫反應發揮作用,誘導炎癥的產生。此外有研究顯示,乙醇可以誘導肝細胞內轉移生長因子α(TGFα)的產生,從而刺激了肝星狀細胞的膠原合成,促進肝臟纖維化的進展。

當機體攝入乙醇時,可以顯著影響血清ALT,AST活性。同時體內肝組織細胞中的自由基代謝平衡就會失調,對自由基的防御能力也會下降,過量自由基可使生物膜脂質雙分子層中的不飽和脂肪酸過氧化,而形成脂質過氧化產物,從而使膜結構和功能發生障礙。過氧化脂質的代謝產物MDA進一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質交聯,生成無活性脂褐質,沉積于組織細胞,破壞細胞膜結構,最后導致細胞無法維持正常代謝而死亡。本實驗的結果表明,與模型組比較,蝦青素各劑量組血清與肝臟組織中MDA含量均明顯減少,說明蝦青素可以促使乙醇所致急性肝損傷模型小鼠MDA含量的升高。

SOD是機體內清除自由基的重要抗氧化酶之一,乙醇的攝入使其活性減弱,引起不飽和脂肪酸氧化生成過氧化物,形成脂褐質,過氧化物可使DNA、蛋白質和酶等改變、破壞,從而加速肝臟損傷。本實驗結果表明,與模型組比較,蝦青素各劑量組小鼠血清與肝臟組織中SOD活性均明顯增強。由此可推斷蝦青素可以抑制乙醇所致急性肝損傷模型小鼠SOD活性的降低。GSHpx是機體內廣泛存在的一種含硒抗氧化酶,可通過特異性催化GSH對氫化氧化物的還原反應,而消除細胞內有害的過氧化代謝產物,以阻斷脂質過氧化連鎖反應,從而對保護細胞代謝的正常進行起到重要作用。隨著機體乙醇攝入的增多,體內自由基水平的不斷增加,GSHpx的活性會降低。本實驗結果表明,與模型組比較,蝦青素各劑量組小鼠血清與肝臟組織中GSHpx活性均明顯增強。由此可推斷蝦青素可抑制乙醇所致急性肝損傷模型小鼠GSHpx活性的降低。

 

綜上所述,本實驗結果表明ASTA蝦青素可以降低血清ALT,AST活性和肝臟組織中MDA含量,升高血清與肝組織中SOD,GSHpx活性,并降低肝細胞脂肪堆積,有效緩解乙醇對肝臟組織的損傷。聯苯雙脂作為目前治療臨床慢性病毒性、黃疸性肝炎的常見藥物,具有較好的治療效果,但長期服用會產生肝腎毒副作用,實驗表明蝦青素可能通過抗氧化途徑改善乙醇性肝損傷,雖作用效果不如聯苯雙脂,但沒有任何毒副作用。因此ASTA蝦青素有可能逐漸成為一種選擇性的輔助藥物運用于此類肝損傷的治療與預防。

 

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